imagesnapravlennyj-mutagenez-s-ispolzovaniem-ptsr-i-perekryvajuschihsja-prajmerov-thumb.jpg

ПЦР в направленном мутагенезе: общие сведения

37°С. Оптимум рекомбинантной Гяд-ДНК-полимеразы в отношении одно- и двухвалентных катионов при ПЦР соответствовал таковому природного фермента. В заключительной серии экспериментов мы исследовали влияние всех четырех <1<1МТР8 на активность модифицированной нами с помощью направленного мутагенеза Тад-ДНК-полимеразы.

ДНК, включая сайт-направленный мутагенез, вставки и делеции. Gibson Assembly Maser Mix эффективно обеспечивает сборку фрагментов ДНК различной сложности, и может быть выбран исследователями при сборке двухцепочечной ДНК из большого количества частей. Так, фрагменты ДНК, полученные сшиванием 6 фрагментов с использованием набора, были использованы для трансформации. В результате отбора были получены четкие гибридизационные сигналы с зондом TPZ-1 с частотой ~0,25%.

Мы используем ее в качестве молекулярного маркера, который позволяет легко отличать препараты нашего фермента от 7а^-ДНК-полимеразы другого происхождения. В экстрактах бактериальных клеток, выращенных при указанных температурах, определяли активность Гад-ДНК-полимеразы.

В ходе выполнения этой части работы нами был инактивация большинства термолабильных бежов бактерии-хозяина, которые вместе с большей частью бактериальной ДНК выпадали в осадок. Природная Tag-ДНК-полимераза дикого типа обладает рядом свойств, ограничивающих ее непосредственное применение в молекулярно-биологических приложениях.

Рис. 6. Схема введения двух мутаций в рекомбинантный ген Taq-JЩK-шшшеразы, повышающих сродство фермента к <1<ШТР8. МТРэ, а также обычных <1СТР, с1ТТР, сЮТР и 33Р-с1АТР в концентрации 15 мкМ каждый. При этом какие-либо сведения о распространенности этих мутаций в РФ отсутствовали.

Метод Гибсона позволяет успешно производить сборку множества фрагментов ДНК, невзирая на длину фрагментов и степень совместимости их концов друг с другом. Сегодня методика широко применяется благодаря своей простоте, возможности применения для больших конструкций ДНК, и тому, что она легко подстраивается для любой конкретной задачи.

В соответствии с данными литературы, в лизатах бактериальных клеток, зараженных рекомбинантными фаговыми частицами, нам не удалось обнаружить активность Taq-полимеразы. В результате образуется гибридный оперон, транскрибируемый с А-Ря-промотора, в котором клонируемый ген является дистальным цистроном этого оперона.

ПЦР в направленном мутагенезе: общие сведения

В качестве встречного праймера использовали 25-звенный олигонуклеотид 5′-CAGCCGGTCGACGTTCTTGAGGAGG. Рис. 4. Экспрессия рекомбинантной Та^-ДНК-полимеразы во время выращивания клеток E.coli при разных температурах. В качестве контроля использовали изогенные клетки, содержащие исходный вектор, в которых активность фермента не была обнаружена.

Рис. 5. Характеристика препарата очищенной 7ад-ДНК-полимеразы. Электрофорез фермента (1) в полиакриламидном геле, 2 — маркер молекулярных масс. Указаны молекулярные массы белков (кДа); б — Термостабильность.

В частности, низкое сродство фермента к дидезоксирибонуклеозидтрифосфатам (ddNTPs) делают невозможным эффективное использорание фермента для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. После его инкубации с рестриктазой Рей и очистки образовавшегося фрагмента О, последним заменяли соответствующий участок ДНК исходной плазмиды. Именно при этих концентрациях сШТв обычно секвенируют ДНК по методу Сэнгера.

Изменение способности рекомбинантной Täq-ДНК-полимеразы использовать ddNTPs в качестве субстратов. Дорожки 2, 3,4 и 5 — соответственно фрагменты В, А, С и О (рис. 9), 1 — молекулярные маркеры; б — Подтверждение первичной структуры синтезированных фрагментов. При этом клонируемый фрагмент оказывался в одной рамке считывания с инициаторным ATG-кодоном вектора. Во-первых, такая система должна была обладать универсальностью, то есть потенциально быть пригодной для обнаружения любых точковых мутаций и в геноме.

Еще интересное: